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    通用PCR試劑盒

    通用PCR試劑盒

    簡要描述:通用PCR試劑盒適用于各種 RNA制品的反轉錄反應以及隨后的PCR擴增。通用PCR試劑盒它采用M-MLV進行反轉錄反應,能夠獲得較長的反轉錄產物。同時,在20ul反轉錄體系和50ul PCR反應體系中,還可以一次性得到足夠量的PCR產物用于后續的克隆實驗。

    產品型號:

    所屬分類:PCR試劑盒

    更新時間:2020-12-17

    詳細說明:

     通用PCR試劑盒

    本試劑盒適用于各種 RNA制品的反轉錄反應以及隨后的PCR擴增。它采用M-MLV進行反轉錄反應,能夠獲得較長的反轉錄產物。同時,在20ul反轉錄體系和50ul PCR反應體系中,還可以一次性得到足夠量的PCR產物用于后續的克隆實驗。本試劑盒中配制的酶均為進口的酶。RT酶采用進口的M-MLV,所以cDNA更長,基因的信息保留得更完整!反轉錄過程中特異的RNase抑制劑可有效降低由于外源RNase污染而導致實驗失敗的風險。本試劑盒使用方便、快捷,可廣泛用于cDNA克隆及目的基因檢測等分子生物學實驗。

    通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)產品簡介

    莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(M-MLV RT)是一種RNA依賴的DNA聚合酶,能使mRNA(>5kb)轉錄為cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相對于禽成髓細胞瘤病毒反轉錄酶較弱,更適合用來反轉錄較長的mRNA。M-MLV RT應用于以RNA為模板合成cDNA的一條鏈。

    注意:M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反轉錄酶,因此要得到和用AMV 反轉錄酶一樣產量的cDNA需加入更多單位的M-MLV反轉錄酶。

    通用RT-PCR試劑盒使用方法

    1)使用方法簡介以用2mg總RNA為例。在無RNase離心管中,加入0.5mg引物至含總RNA的樣品中,總體積不大于15ml。70℃,5分鐘打開模板鏈形成的二級結構。立即放于冰上降溫防止二級結構恢復,隨后短暫離心使液體集中在離心管底。

    2)加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。

    注意:不要改變引物的加入比率。

    通用PCR試劑盒常見問題與解決方法:

    常見問題

    可能原因

    解決方法

     

     

    陽性對照、待測樣本均無條帶。

    PCR反應體系或反應條件不合適。

    使用梯度PCR摸索PCR反應條件。

    PCR試劑保存不當失去活性。

    2× PCR Mix應保存于-20℃,使用時避免反復凍融。若使用頻繁,可在4℃短時間存放。

    引物設計問題。

    嘗試重新設計引物進行檢查。

     

     

     

     

     

     

    陽性對照有目的條帶,待測樣本無條帶或條帶弱。

    不當儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。

    使用新鮮的試劑。

    加入組織裂解液過量。

    增大反應體系,或減少裂解液的用量。

    樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久,DNA基因組已經降解。

    裂解混合液液可在4℃保存2-3天,盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。

    模板加入量不適合。

    在反應體系10-20%范圍內優化模板加入量。反應效性能較差時,可以降模板濃度調節到低于10%的范圍。

    PCR循環數不足。

    適當增加PCR的循環數,推薦在35-40循環為佳。因為模板復雜,一般PCR反應要比用純化的 DNA模板多5-10個循環為佳。

     

     

     

    非特異性擴增

    PCR退火溫度太低,循環數、引物濃度或模板濃度太高。

    增加PCR退火溫度,降低PCR循環數、引物濃度或模板濃度。

    PCR引物錯配。

    重新設計PCR引物。

    配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。

    PCR反應體系的配制在低溫下進行,配制完成后盡快進行PCR擴增反應。

     

     

     

    陰性對照出現目的條帶

    操作工具或試劑污染。

    實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。

    樣本間交叉污染。

    每個取樣器只對一個樣本使用;或取完一個樣本后,將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中,反復涮洗,然后用干凈的紙巾擦干殘液。

     

     



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