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    探針法熒光定量PCR試劑盒

    探針法熒光定量PCR試劑盒

    簡要描述:探針法熒光定量PCR試劑盒是使用探針法進行qPCR實驗的 即用型優化預混液。兼容所有的qPCR檢測儀器,多種模板。探針法熒光定量PCR試劑盒使用時僅需加入模板、探針和引物即可進行實驗。

    產品型號:

    所屬分類:PCR試劑盒

    更新時間:2024-01-26

    詳細說明:

    探針法熒光定量PCR試劑盒它具有下列特點:

     

    1. 即開即用,用戶只需要提供樣品RNA模板。

     

     

    2. 引物和探針經過優化,靈敏性高。

     

     

    3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。

     

     

    4. 特異性高,引物是根據小反芻獸疫病毒高度保守區設計,不會跟其他病毒的RNA發生交叉反應。

     

     

    5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

     

     

    6. 本產品只能用于科研。

     

     

     

     

     

    規格及成分

     

     

     

    成分

     

     

    編號

     

     

    十孔盒包裝

     

    探針法 qRT-PCR 緩沖液

     

    A

     

    500μL(黃蓋)

     

    探針法 qRT-PCR 酶混合液

     

    B

     

    100μL(紅蓋)

     

    熒光 PCR 模板稀釋液

     

    C

     

    1 mL(黃蓋)

     

    探針法 qRT-PCR引物混合液

     

    D

     

    100 μL(白蓋)

     

    小反芻獸疫病毒 qRT-PCR 探針

     

    E

     

    50 μL(棕色管)

     

    探針法 qRT-PCR陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)

     

    F

     

    50 μL(黃蓋)

     

    核酸釋釋劑(試用裝)

     

    G

     

    20 次(1mL,綠蓋)

     

    使用手冊

     

    H

     

    一份

     

    運輸及保存 低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月。

     

     

    探針法熒光定量PCR試劑盒自備試劑 :樣品 RNA。

     

     

    使用方法

     

     

    一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

     

     

    1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。

     

     

    2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。

     

     

    3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

     

     

    4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

     

     

    5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

     

     

    6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

     

     

    二、樣品 RNA 的制備

     

     

    7. 如果有N個樣品,設置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。

     

     

    8. 用自選方法純化樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝,該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板,省略了RNA提取步驟。

     

     

    三、Probe qRT-PCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)

     

     

    9. 如果做定量分析并且只做1次重復,則標記N+9個PCR 管,其中N+2個用于上步得到的 N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復,則標記N+4 個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1個用于PCR陽性對照(用第4號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

     

     

    10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加):

     

     

     

     

    成分

     

     

    樣品管N+2個

     

     

    RT-PCR陰性對照管

     

     

    標準曲線樣品管

     

     

    (2-7 管)

     

    探針法qPCR緩沖液

     

    各 10 μL

     

    10 μL

     

    各 10 μL

     

    探針法 qPCR 酶混合液

     

    各 2 μL

     

    2 μL

     

    各 2 μL

     

    qRT-PCR探針

     

    各 1 μL

     

    1 μL

     

    各 1 μL

     

    探針qRT-PCR

     

    引物混合液

     

    各 2 μL

     

     2 μL

     

    各 2 μL

     

    待測樣品 RNA 模板

     

    各 5 μL

     

    --

     

    --

     

    超純水

     

    --

     

    5 μL

     

    --

     

    第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7 號)

     

    --

     

    --

     

    各5 μL(2號樣到2號管,3號樣到3 號管…)

    • 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 qRT-PCR:

     

     

    過程

     

     

    溫度

     

     

    時間

     

    逆轉錄

     

    50℃

     

    30 min

     

    預變性

     

    94℃

     

    10 min

     

    qRT-PCR 反應(40 個循環)

     

    94℃

     

    15 sec

     

    60℃

     

    1 min(采集 FAM 通道的熒光信號)

     

    五、數據處理

     

     

    12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。

     

     

    13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 35,則為陽性。

     

     

    六、常見問題與解決方法:

     

     

     

    常見問題

     

     

    可能原因

     

     

    解決方法

     

     

     

    陽性對照、待測樣本均無條帶。

     

    PCR反應體系或反應條件不合適。

     

    使用梯度PCR摸索PCR反應條件。

     

    PCR試劑保存不當失去活性。

     

    2× PCR Mix應保存于-20℃,使用時避免反復凍融。若使用頻繁,可在4℃短時間存放。

     

    引物設計問題。

     

    嘗試重新設計引物進行檢查。

     

     

     

     

     

     

     

    陽性對照有目的條帶,待測樣本無條帶或條帶弱。

     

    不當儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。

     

    使用新鮮的試劑。

     

    加入組織裂解液過量。

     

    增大反應體系,或減少裂解液的用量。

     

    樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久,DNA基因組已經降解。

     

    裂解混合液液可在4℃保存2-3天,盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。

     

    模板加入量不適合。

     

    在反應體系10-20%范圍內優化模板加入量。反應效性能較差時,可以降模板濃度調節到低于10%的范圍。

     

    PCR循環數不足。

     

    適當增加PCR的循環數,推薦在35-40循環為佳。因為模板復雜,一般PCR反應要比用純化的 DNA模板多5-10個循環為佳。

     

     

     

     

    非特異性擴增

     

    PCR退火溫度太低,循環數、引物濃度或模板濃度太高。

     

    增加PCR退火溫度,降低PCR循環數、引物濃度或模板濃度。

     

    PCR引物錯配。

     

    重新設計PCR引物。

     

    配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。

     

    PCR反應體系的配制在低溫下進行,配制完成后盡快進行PCR擴增反應。

     

     

     

     

    陰性對照出現目的條帶

     

    操作工具或試劑污染。

     

    實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。

     

    樣本間交叉污染。

     

    每個取樣器只對一個樣本使用;或取完一個樣本后,將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中,反復涮洗,然后用干凈的紙巾擦干殘液。

     

     

     

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